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1539年，土耳其艦隊攻擊並摧毀了利馬索爾（Limassol）。
由於擔心日益擴張的奧斯曼帝國，威尼斯加強了法馬古斯塔（Famagusta）、尼科西亞（Nicosia）和基爾尼亞（Kyrenia）的防禦，但大多數其他城市卻易於被攻陷。
到1563年，威尼斯的人口已降至約16.8萬人。
1570年夏季，土耳其人再次發起進攻，但這次是全面入侵，而非突襲。
約6萬名軍隊，包括騎兵和炮兵，在穆斯塔法·帕夏（mustafa pasha）的指揮下，於1570年7月2日無阻地登陸在利馬索爾附近，並對尼科西亞發起圍攻。
在城市陷落的那一天，即1570年9月9日，2萬名尼科西亞居民被處死，所有教堂、公共建築和宮殿都遭到洗劫。
屠殺的訊息迅速傳播，幾天後，穆斯塔法毫無抵抗地攻佔了基爾尼亞。
然而，法馬古斯塔進行了抵抗，防禦持續到1570年9月直至1571年8月。
法馬古斯塔的淪陷標誌著塞普勒斯進入奧斯曼時期。
兩個月後，由威尼斯、西班牙和教皇艦船組成的聖聯盟海軍，在奧地利的唐·胡安（don John of Austria）指揮下，在勒班託戰役（battle of Lepanto）中擊敗了土耳其艦隊。
儘管在海上戰勝了土耳其人，塞普勒斯仍在接下來的三個世紀中處於奧斯曼統治之下。
到1575年，威尼斯的人口約為17.5萬人。
但部分由於1575到1576年的瘟疫，到1581年，人口降至12.4萬人。
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根據經濟歷史學家揚·德·弗里斯（Jan de Vries）的說法，到17世紀初，威尼斯在地中海的經濟實力已經顯著下降。
德·弗里斯將這種衰退歸因於香料貿易的喪失、競爭力下降的紡織工業、復興的天主教會在圖書出版方面的競爭、三十年戰爭對威尼斯主要貿易伙伴的不利影響，以及棉花和絲綢進口成本的增加。
1606年，威尼斯與教皇國之間發生了衝突，因兩名被指控輕微犯罪的神職人員被捕，以及一項限制教會享有和獲取土地財產的法律。
教皇保羅五世（pope paul V）認為這些條款違反教會法，並要求廢除。
當這一要求被拒絕後，他對威尼斯施加了禁令，禁止神職人員執行幾乎所有的祭司職責。
威尼斯對此禁令和逐出教會的行為毫不在意，命令其神父繼續履行職務。
威尼斯在這一決定上得到了修士保羅·薩爾皮（paolo Sarpi）的支援，他是一位尖銳的爭議作家，並於1606年被任命為威尼斯議會的神學和教會法顧問。
禁令在一年後被解除，法國介入並提出了一項妥協方案。威尼斯對重申任何公民都不高於正常法律程式的原則感到滿意。
與哈布斯堡西班牙和神聖羅馬帝國的競爭導致威尼斯在義大利和北亞德里亞海的最後幾場重要戰爭。
1615年至1618年間，威尼斯在烏斯科克戰爭（Uskok war）中與奧地利的費迪南德大公（Archduke Ferdinand）交戰，在北亞德里亞海和共和國的東部邊界作戰。
而在西部的倫巴第，威尼斯軍隊在1617年與西班牙米蘭總督佩德羅·德·托萊多·奧索里奧（don pedro de toledo osorio）的部隊在克雷馬（crema）附近發生小規模衝突，1618年又在倫巴第鄉村進行交戰。
在同一時期，西班牙那不勒斯總督佩德羅·特列斯-吉
