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武士為中心的&ldo;尊王攘夷派&rdo;受到迫害。得到天皇支援的幕府不僅將尊王攘夷志士趕出京都，並藉口作為尊王攘夷派大本營的長州藩軍隊擅入京都而討伐長州藩，迫使長州藩俯首稱臣。
此時，尊王攘夷派的觀念發生轉化，即從尊王攘夷轉向尊王倒幕。因為開港以後，面對咄咄逼人的西方侵略勢力，下級武士主張以武力加以反對，因而時常有外國計程車兵、使館人員、商人甚至艦船在日本受到攻擊的事件發生，其中的&ldo;生麥事件&rdo;和&ldo;下關事件&rdo;均引起與外國的區域性戰爭。1862年9月，薩摩藩武士在神奈川縣生麥村因道路糾紛而殺死英國商人，第二年7月英國七艘軍艦炮擊薩摩藩的鹿兒島，摧毀了炮臺，並焚燒了市區，薩摩藩被迫接受&ldo;賠償&rdo;、&ldo;懲兇&rdo;等屈辱條件；1863年6月，長州藩炮擊透過下關海峽的外國商船和軍艦，並封鎖下關海峽。1864年9月，英、美、法、荷四國聯合艦隊進攻下關，並攻陷了所有炮臺，長州藩被迫求和。&ldo;薩英戰爭&rdo;和&ldo;下關戰爭&rdo;使主張尊王攘夷的下級武士意識到，在與外國武力相差懸殊的狀況下進行攘夷是輕率的，抵禦西方勢力入侵，保障國家安全，只能打倒傳統的幕府，建立一個強有力的、統一的近代民族國家。
正是在上述共同認識的基礎上，西南兩大強藩逐漸接近。在土佐藩出身的藩士坂本龍馬的斡旋下，長州藩代表木戶孝允和薩摩藩代表西鄉隆盛在1866年3月簽定密約，商定兩藩結成討幕軍事同盟。正因如此，當同年7月幕府以&ldo;私購武器&rdo;、&ldo;私自對外貿易&rdo;等罪名準備發動第二次討伐長州的戰爭時，曾是第一次討伐長州戰爭主力的薩摩藩拒絕出兵，結果幕府不得不以將軍去世而草草結束了這次不得人心的戰爭。1867年1月，主張公武合體的孝明天皇死亡，年僅15歲的太子睦仁即位，皇室公卿三條實美、巖倉具視等立即與西南諸藩策劃武裝討幕，其他諸藩也加快了結盟舉兵的步伐。1868年底，新天皇頒布&ldo;王政復古大號令&rdo;，宣佈廢除幕府，並命令幕府末代將軍德川慶喜&ldo;辭官納地&rdo;，即辭去內大臣等所有職務，交出半數領地給朝廷，此後一切權力重新歸於天皇。與此同時，倒幕派組成了新的政府。
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